Il protagonista del nuovo gioco è un nobile fiorentino antenato di Desmond Miles e discendente di Altair, di nome Ezio Auditore. L' avventura inizierà nell'anno 1486 che corrisponderà all'epoca del rinascimento e oltre ad essere dotato di due lame, il "nuovo Altair" non si è sottoposto al rito del taglio delle dita per permettere la fuoriuscita delle lame dai pugni, quindi le userà in maniera diversa da quanto visto nel primo gioco. Nel corso dell'avventura è possibile vedere alcune delle location che ospiteranno questo nuovo episodio e sono: la Basilica di San Marco, il Canal Grande e il Ponte di Rialto, ma potremo visitare anche alcuni luoghi della campagna Toscana. Ezio Auditore potrà spostare nei seguenti luoghi o a piedi o a cavallo, mentre a venezia avrà la possibilità di nuotare nei canali e restare immerso finché il suo fiato glielo permetterà. Ci saranno nuovi metodi di gameplay che il protagonista potrà utilizzare come ad esempio uccidere un nemico silenziosamente e potrà avere nuovi armi a disposizione tra cui un'ascia, una mazza, un martello, una lancia, un paio di spade e due diversi tipi di piccole lame, tutte dotate di caratteristiche diverse. E' stata implementata anche la funzione grazie alla quale sarà possibile sottrarre le armi al nemico ucciso, permettendo così una vasta gamma di scelta di armi! La giornata sarà divisa fra giorno e notte e avrà 16 missioni differenti fra di loro che scompariranno e compariranno a seconda della reputazione di Ezio ,nel corso del gioco si incontreranno nuovi personaggi storici fra Machiavelli,Caterina Sforza e Lorenzo De Medici. E' stato confermato il laboratorio di Leonardo Da Vinci vedremo questo personaggio insieme alla Gioconda,si potranno utilizzare anche le sue invenzioni come ad esempio volare, utili per planare tra un tetto e l'altro. Nei vari scenari si potranno trovare oggetti nascosti come emblemi, statue ed altro che andranno a sbloccare contenuti bonus.
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